2 结果与讨论

2.1 醇脱氢酶的醇脱催化筛选

对酶库进行有针对性的筛选是获得新酶的有效途径之一。分别以NADPH和NADH为辅酶，氢酶以N-Boc-3-哌啶酮(NBP0)为底物。合成在340nm对实验室保存的醇脱催化还原酶库进行高通量活力筛选。通过筛选发现，氢酶对NBP0具有还原活力的合成还原酶均为NADPH依赖型。进一步对有活力的醇脱催化还原酶进行立体选择性分析，结果见表1。氢酶经过活力的合成筛选得到6种对NBPO具有一定催化活力的还原酶，立体选择性较高的醇脱催化有4种：KpADH、CgKRl、氢酶PAR、合成Cg26。醇脱催化其中Cg26的氢酶立体选择性为尺构型，其余3种为S构型。合成考虑到适用于大规模的酶法制备，一些商业参数指标需要参考。例如生物催化剂载量，其决定反应过程中酶制剂的经济效应。较高的比活力有利于生物催化剂在较低的载量下实现底物浓度载量上的生物转化数,从而实现经济高效的生物催化过程。同时，前期工作中获得了KpADH的晶体结构并对KpADH的立体选择性机制做了深入的分析，有利于后续的立体选择性改造。从表1来看，KpADH较高的比活力在大规模的制备中更具有明显的优势。所以，选取来自尉Kluyveromycespolyspora的KpADH为后续研究对象。

2.2 不同底物浓度对转化率的影响

具有应用前景的生物催化反应通常底物上载量应大于100g/L，故首先考察了KpADH对高浓度NPB0的耐受情况。根据文献报道，NBPO为疏水性底物。因此,在10mL的反应体系中加入5％的乙醇助溶，并加入相同的酶量(200U)考察不同底物浓度对反应的影响。如图1所示，随着反应时间的增加，转化率快速趋于稳定。当底物浓度为250mmol/L时，反应可实现完全转化，然而在底物浓度分别为500mmol/L和1mol/L时，底物的转化水平分别为390mmol/L和460mmol/L。底物浓度较高的两个反应都快速终止在400mmol/L的转化水平,且延长反应时间后转化率并未得到改善。测定30℃KpADH的半衰期为80h，说明勋ADH的稳定性良好。但在加入底物反应1h左右,反应快速终止在400mmol/L的转化水平，说明反应过程中较高的底物或产物浓度抑制了KpADH合成产物(S)-NBHP。该现象与之前报道的YDR541C在单水相催化中受到严重的抑制结果一致。说明可能是产物抑制导致的。因此，作者考察不同浓度的产物对不对称还原反应的影响。
 

2.3 不同产物浓度对转化率的影响

在1mL反应体系中加入相同酶量(0.015U)、相同的底物浓度(50mmol/LNBPO)和不同的产物浓度(0-250mmol/LNBPH)。考察不同产物浓度对KpADH催化还原NBPO反应的影响，结果见图2。随着产物浓度的增加，反应转化率逐渐降低，直到反应转化率接近3％，说明产物抑制是影响NBP0转化反应的关键因素。

2.4 底物和产物抑制动力学拟合分析

分别考察了不同浓度的底物和产物存在的条件下KpADH比活力的变化，并通过拟合获得相应的动力学常数，见图3。经过底物动力学测定，在高浓度底物的条件下KpADH的活力没有明显降低，K_m值为(17.4±1.1)mmol/L，V_max值为(88.3±2.2)μmol/(min·mg)，未发现明显底物抑制的现象。在加入不同浓度的产物后，KpADH的比活力呈现不同程度降低，见图3(b)的拟合曲线。通过抑制动力学拟合分析和0rigin软件评估拟合结果，非竞争抑制方程的拟合程度最高，R-Square值高达0.98(R-Square越接近1，说明拟合程度越高)。获得抑制常数民值为(459.9±118.6)mmol/L，K_i值为(9.9±1.0)mmol/L，V_max-值为(83.9±2.9)μmol/(min·mg)。上述反应体系中加入助溶剂乙醇以增加产物的水溶性,当达到产物的抑制浓度后反应受到抑制而进入平台期。

经过拟合评估，该抑制类型属于非竞争性抑制。这说明产物与酶的非活性部位相结合，形成产物和酶的络合物后会进一步再与底物结合：或者是酶与底物结合形成底物和酶络合物后，部分再与产物结合。虽然底物、抑制物(产物)和酶的结合无竞争性，但两者与酶结合所形成的中间络合物不能释放产物，导致了酶催化的表观反应速率降低。

据报道，NADPH依赖性的羰基还原酶YDR541C在单水相反应体系中进行NBP0(100～400mmol/L)的不对称转化，300mm01/L的NBP0可以在1h内完全转化，由于产物抑制作用，400mmol/L的NBPO转化率仅为81.7％。最终反应停留在300mmol/L的转化水平。与还原酶PsCR一样，在单水相体系中将4-氯-3-氧代丁酸乙酯(COBE)不对称催化还原为(5)-4-氯-3-羟基丁酸酯(S)-CHBE)，当产物浓度达到120mmol/L时，反应速度急剧下降。作者通过动力学拟合分析，当达到抑制浓度400mmol/L时，产物与底物非竞争性地结合KpADH形成三元复合物，使KpADH构象改变，不能进一步释放产物，导致酶活力下降。这种非竞争性抑制作用不能通过增加底物浓度来解除抑制。因此，在不同的底物浓度下硒ADH的转化水平停留在400mmol/L。

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